細胞培養や生物実験ではHEPESバッファphenol red indicator が同時に用いられる.前者は培養基内のpH安定を維持するために用いられ,後者はpH変化を視覚的に表示するために用いられる.しかし,化学的性質の観点から両者の間の相互作用は色異常を引き起こす可能性がありますこの記事では,この現象の原因を分析し,簡素化された最適化ソリューションを提供します.
色の干渉の化学的基礎
フェノル赤は,酸性またはアルカリ性によって色を変えるpH敏感染料で,酸性環境 (pH<6.8) で黄色で,中性環境 (pH ≈7.4) で赤で表示されます.アルカリ性環境 (pH>8) で紫色.2) この特性により,細胞培養基地のpHをモニタリングするための理想的なツールとなります.
緩衝物質としてのHEPESの主な機能は,水素イオンを放出または吸収することによってpHを安定させることである.HEPES分子内の硫酸群は,フェノール赤と似た化学構造を持っているHEPESの濃度が高ければ,フェノールレッドと相互作用して分子構造を変えます.この変化により,フェノール赤の色が明るくなり,特定のpH値で変化する例えば,pH7で標準の赤の代わりにオレンジ色の赤色に見えるかもしれません.4.
干渉現象の直感的な表れ
通常の細胞培養では,HEPESの高濃度 (例えば20mmol/L以上) とフェノル赤を同時に使用すると,培養基質の色は予想よりも明るく,または黄色くなります..例えば,pH 7.4 の培養基質が赤色で表示されるべきであった場合,HEPES の干渉により淡いオレンジ色になり,研究者がpH値を誤って判断した可能性があります.
フローレンス顕微鏡観測では,この干渉はより顕著である.フェノル赤は特定の波長でフローレッセンスを放出するが,HEPESはフローレッセンスの信号の一部を吸収することができる.画像の明るさが低下したり,背景ノイズが増加したりするこの効果は,細胞の真の状態を隠すことができる長期観察や生細胞画像実験において特に顕著です.
簡略化された最適化計画
HEPES 濃度を調整する
1伝統的な栽培:HEPESの濃度を10〜15 mmol/L以内に制御し,フェノール赤の色発達に最小限の干渉をもたらし,pHの安定性を効果的に維持することができます.
2短期間実験:実験時間が短ければ (<4時間など) HEPES の濃度をさらに5mmol/Lに減らしたり,必要に応じて追加したりできます.
3敏感な細胞: pH 変化に非常に敏感な細胞 (ニューロンなど) では,HEPES の代わりにバイカーボネートバッファシステムを使用するか,フェノルレッドを完全に除去することを推奨します.
代替色表示方法
1フェノル赤のない培養基:HEPESの高濃度を必要とする実験では,フェノル赤のない培養基を選択できます.酸性やアルカリ性をモニターするために,pHテストストライプや電子pHメーターを使用できます..
2. 発光探査機:フェノール赤の代わりにBCECF-AMのような発光染料を使用すると,これらの探査機はHEPESの干渉の影響を受けず,より正確なpH測定を提供することができます.
3色の修正: HEPES とフェノル赤が同時に使用されなければならない場合,色測定法によって観測された色偏差を修正するために,標準曲線を事前に準備することができます.
実験設計の最適化
1段階的なバッファリング: 細胞の培養前段階ではpHを維持するためにHEPESを使用し,画像処理の前に干渉を減らすためにHEPESのない培養基に切り替える.
2波長選択: 投光画像では,フェノル赤の主要吸収波長 (例えば560nm) を避け,背景干渉を減らすために,より長い波長のフラウレセンスのチャネル (例えば633nm) を選択する.
3コントロール設定: HEPES を使わないコントロールグループを各実験に設置し,色差を視覚的に比較しました.
HEPESとフェノール赤の相互作用メカニズムを理解することで研究者は,文化システムの安定性を維持しながら,色開発の結果の信頼性を確保するために実験条件を簡単に調整することができます複雑な実験では,最適化計画の有効性を検証するために,まず小規模な予備実験を行うことが推奨されます.
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